PERANAN ENZIM DALAM BIOTEKHNOLOGI MELIPUTI BERBAGAI JENIS ENZIM RESTRIKSI ENDONUKLEASE DAN EKSONUKLIASE, LIGASE DAN POLIMERASE NUKLEOTIDA.

A. Enzim Restriksi  Endonuklease dan Eksonukliase.

Enzim restriksi atau endonuklease restriksi adalah enzim yang memotong molekul DNA. Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa.Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa.

Peranannya .

Restriksi endonuklease adalah memotong DNA pada urutan basa yang spesifik dan menghilangkan residu nukleutida dari ujung 3’ untai DNA.

Restriksi eksonuklease adalah memotong DNA pada urutan basa yang spesifik dan menghilangkan residu nukleutida dari ujung 5’ suatu dufleks untuk membuka ujung untai tunggal.

Sekuens pengenal enzim restriksi

Tabel 1 Contoh enzim restriksi beserta sekuen pengenalannya
Enzim	Sekuen Pengenalan
BamHI	GGATCC CCTAGG
NotI	GCGGCCGC CGCCGGCG
Sau3AI	GATC CTAG
SacI	GAGCTC CTCGAG
Sst I	GAGCTC CTCGAG
HinfI	GANTC CTNAG
XhoII	PuGATCPy PyCTAGPu

Sekuen pengenalan atau sering disebut juga situs pengenalan merupakan sekuen DNA yang menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan pemotongan pada sekuen tersebut. Panjang sekuen pengenalan enzim restriksi berbeda-beda, seperti enzim EcoRI, SacI, dan SstI mempunyai sekuen pengenalan sepanjang 6 pasang basa, sedangkan NotI 8 pasang basa, dan Sau3AI hanya 4 pasang basa. Kebanyakan dari enzim restriksi bersifat palindromik (palindromic) yang berarti sekuen pengenalan sama jika dibaca dari 5’3’ baik utas atas maupun utas bawah. Contohnya adalah HindIII dengan situs pengenalan 5’-AAGCTT-3’ (utas atas)/3’-TTCGAA-5’ (utas bawah).

Perkiraan Pemotongan

Panjang dari sekuen pengenalan mempengaruhi seringnya enzim restriksi memotong DNA dalam ukuran tertentu. Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida. Perhitungan tersebut diperoleh dengan mengasumsikan setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4)⁶ = 1/4096. Perhitungan ini hanya sebagai perkiraan, pada kenyataannya belum tentu demikian.

Hasil Pemotongan Enzim Restriksi

Enzim restriksi yang biasa digunakan dalam laboratorium biologi molekuler memotong molekul DNA pada situs pengenalan dan menghasilkan salah satu dari ketiga jenis pola hasil pemotongan. Ketiga pola hasil pemotongan enzim restriksi sebagai berikut:

Ujung menggantung 5’

Enzim restriksi memotong secara asimetris pada situs pemotongan, menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 5’. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5’ adalah BamHI

Ujung menggantung 3’

Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan, namun menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI

Ujung tumpul

Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI

Pola ujung menggantung, baik yang 3’ ataupun 5’, sering disebut juga dengan ujung lengket (sticky ends) atau ujung kohesif (cohesive ends). Pola seperti ini lebih mudah menempel (annealing) dengan pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang menggantung.

B. Enzim Ligase dan Polimerase nukleotida.

Enzim ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick. Nick pada DNA dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan. Secara biologis, DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA. Oleh karena pentingnya peranan DNA ligase, sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase. Dengan diinhibisinya DNA ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi dan sel akan mati. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam sel, maupun di luar sel. Untuk penggunaan di luar sel, penggabungan dengan enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA rekombinan. Enzim restriksi diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita untuk memotong DNA di tempat yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional

Peranannya.

Enzim Ligase adalah menyambung dua molekul/fragmen DNA.

Mekanisme Enzim Ligase

Mekanisme DNA ligase dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu NAD⁺ atau ATP. Peristiwa ini menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan grup α-amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi), jika kofaktor berupa ATP; atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika kofaktor berupa NAD⁺. Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA. Pada akhirnya, iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-fosfat dan melepaskan AMP dan enzim adenylate.

Enzim polymerase nukleotida adalah enzim penting dalam replikasi DNA maupun dalam reparasi DNA. DNA polimerase merupakan sebuah enzim yang mengkatalisasi reaksi polimerisasi deoksiribonukleotida menjadi rantai DNA, dengan kata lain enzim ini mengkatalisasi reaksi pembentukan DNA. DNA polimerase pertama kali ditemukan pada tahun 1957 oleh Arthur Kornberg. DNA polimerase membaca rantai DNA utuh sebagai cetakan (templat) dan menggunakannya untuk membentuk rantai baru. Molekul polimer yang baru terbentuk merupakan komplemen atau pasangan dari rantai yang digunakan sebagai cetakan, dan identik dengan pasangan dari rantai cetakan sebelum terjadi reaksi.

Peranannya.

Enzim Polimerase adalah mengisi kekosongan dalam dufleks dengan penambahan nukleotida pada ujung 3’.